分离技术问题中最佳优化与最稳定优化的对比

FDA是QbD概念最积极的倡导者和推动者。为了使色谱技术得到更好的发展，美国FDA要求利用QbD(质量源于设计)理念制定针对色谱技术的系统实验计划，以取代目前仍被广泛使用的试错法。

本文作者Hans-Werner Bilke为HPLC技术服务专家;Stefan Moser为过程最佳化技术专家。

图1.寻找最佳工作点时的单纯性值分析评估;最佳工作点有关数据：梯度时间tG=38.3分钟、温度T=30.1摄氏度、乙腈中的甲醇三元提取剂成分tC=4.0%、初始浓度%Bs=5.7%、最终浓度%Be=90%、酸碱度PH值=2.9、流动系数F=1.4ml/分、滞留容积=1.06ml。

21世纪初，美国推出QbD(质量源于设计)理念。QbD(Quality by Design，)，其定义是：在可靠的科学和质量风险管理基础之上的，预先定义好目标并强调对产品与工艺的理解及工艺控制的一个系统的研发方法。质量不是通过检验注入到产品中，而是通过设计赋予的。而良好的设计，得益于对产品的认知和对生产的全过程控制。

确定方法的稳定耐用性、整体最佳性是新分离技术研发的基础。所以研发人员需要对液相色谱技术有更深入的理解，以便定义方法的设计空间。

在高效液相色谱法的设计空间中，方法学中的许多参数都要满足规定的色谱分析任务所带来的风险性要求。为了能够可靠的估计设计空间，就需要有高数据质量和一套完整的结构模式。

QbD包括质量风险管理、平台、设计空间、和过程分析技术。在DoE统计软件的帮助下，可以通过相对较少次数的尝试模拟HPLC法中存在的问题。另外，利用此法也能满足当局对经久耐用的稳定工作点、工作范围的高可靠性评估要求。

基于经验的过程模型和统计学的试验方法

液相色谱分离过程的质量与许多因素有关。如梯度时间(tG)、温度(T)、三元提取剂成分(tC)、有机提取剂B、B的初始浓度(%Bs)和最终浓度(%Be)、水质提取剂A的酸碱度PH值以及流动系数(F)等都是重要的影响因素。对这些影响因素逐一逐步优化是非常费时费力的，而且得到的结果不一定是最佳优化条件。

在制药生产领域中，用于药品小分子分离的高效液相色谱技术实践中，影响因素明显多于3个(或达10个)，而且这些影响因素之间的相互作用会使得问题更为复杂。弄清楚这些因素之间的关系及相互作用，才能够对高效液相色谱法进行整体性优化。在所有的峰值选择性分离技术领域中，重要的目标值是关键分辨率R^_skrit(色谱图中最差被分离峰值的分辨率)以及色谱图中最后一个峰值的停滞时间tR_max的最短化。

上述种种影响因素都属于重要的质量标志;因此要在统计试验SVP中利用方法学技术搞清楚。在实验确定各个因素之前要确定各个参数变量的区间，也就是要设定实验时参数取值的窗口。

在选定一个试验计划、或者说是选定一个试验程序时，知道哪些参数在变量区间内会对试验结果有影响是很有必要的，可以大大缩小需考虑的影响因素范围，本文采用的是Rechtschaffner实验设计。其允许测定所有的线性主效应、还会对可能的非线性进行二次逼近以及不将所有的交互影响交织在一起。

最佳的和稳定的分离工作点

为了找到HPLC高效液相色谱分离的工作点，一方面要在实验中对所有的影响因素、变量在其取值区间内进行变化，另一方面也可能会得到多个优化的目标量。

最佳的工作点：是将所有目标量最佳化，再利用单纯性算法语言来求解出来。此算法语言能够同时改变所有变量参数，从而把实现目标值的试验次数减少到最少，也能够把接近目标值的级差间隔缩小到最小。

本文后续内容中将把这一观念称之为log(D)函数值。当log(D)函数值为零时，表示找到了这些参数的目标工作点。由于是同时从多个不同起点开始的单纯性算法优化，因此也可以把log(D)函数值最小的一点确定为最佳工作点(见图1)。以找到的最佳工作点为基础，可以确定各个参数在所有参数区间内该参数与技术规范规定的极限值之间的(Manhatten)级差间隔，它表示的是最稳定的工作点。第一个设计空间是根据所选择的参数和技术规范中给出的数据确定的。

确定最稳定工作点的运算次数要考虑所有的峰值和参数：

运算的次数=目标量的次数x分析因子^{参数的数量}。当分析因子数量不多时(本例为7个，参数区间为8)，按照上式计算出来的运算次数就高达35651584次了;因此是一项耗时巨大的运算过程。

图2.寻找最稳定工作点的FRS工具;最稳定工作点有关数据：梯度时间tG=31.4分钟、温度T=34.3摄氏度、乙腈中的甲醇三元提取剂成分tC=14.3%、初始浓度%Bs=5.7%、最终浓度%Be=91.4%、酸碱度PH值=3.0、流动系数F=1.4ml/分、滞留容积=1.06ml。

在图2中给出了稳定工作点时的参数位置。HPLC高效液相色谱分离技术优化的结果汇总在表1中。两个工作点的参数值梯度时间(tG)、温度(T)、三元提取剂成分(tC)差异很大。目前还很难实现三维空间的设计空间。所做到的设计空间‘探索者’允许在此空间内进行二维投影。‘探索者’设计空间中找到的最稳定工作点用叉号表示(见图3)。

图3.最稳定优化的‘探索者’设计空间;为时间梯度tC和酸碱度PH值找到了最稳定的工作点。

图4.最佳优化的‘探索者’设计空间;为时间梯度tC和酸碱度PH值找到了最稳定的工作点：梯度时间tG=38.3分钟、温度T=30.1摄氏度、乙腈中的甲醇三元提取剂成分tC=4.0%、初始浓度%Bs=5.7%、最终浓度%Be=90%、酸碱度PH值=2.9、流动系数F=1.4ml/分、滞留容积=1.06ml。

图5.最稳定优化的‘探索者’设计空间;为时间梯度tC和酸碱度PH值找到了最稳定的工作点：梯度时间tG=31.4分钟、温度T=34.3摄氏度、乙腈中的甲醇三元提取剂成分tC=14.3%、初始浓度%Bs=5.7%、最终浓度%Be=91.4%、酸碱度PH值=3.0、流动系数F=1.4ml/分、滞留容积=1.06ml。

‘探索者’设计空间的界线考虑了模型误差(X,Y)，可重复再现性和参数在X坐标上的准确性以及每百万次采样数的缺陷率最小值为1000(99.9%的在技术规范规定以内)。

在最稳定的工作点处允许使用最大的参数变量值且不会超出设计空间的界线，也就是说，参数的调整出错风险非常小，例如为设计空间的0.1%，不会影响HPLC高效液相色谱分离的质量(R_s,krit≥1.5;tR_max≤20分钟)。

工作点分析：工作点分析是从最佳工作点或者最稳定工作点出发确定极限值与风险性相互关系的一件工具。利用工作点分析这一工具可以估计各个参数在各自工作点处的最大允许公差、或者说是最大允许偏差。此时，也可以对参数的设置精度进行数学计算。为了把HPLC高效液相色谱分离技术优化可能出现的风险减小到最低，应考虑：这些参数中的不可靠因素各会带来什么后果，单一模型中的不可靠性会对目标值带来什么影响。风险评估方法本身就在极限值的范围内了，按照蒙特卡洛模拟计算出来，并用最大失误分析百分比的形式表示(超出技术规范的可能性)，或用Plot设计空间中的DPMO轮廓线来表示的(见图4和图5)。

各图所表示的是在乙腈中的甲醇三元提取剂(tC)=0～100%和水质提取剂A的酸碱度PH值2.0～3.2之间基础上所进行的试验而绘制的。图中的绿色区域表示的是失误率小于0.1%、满足技术规范要求概率很高(R_s,krit≥1.5;tR_max≤20分钟)的设计空间。

这一最稳定区域的面积明显的大于最佳优化区域的面积。

表1.七大因素优化的最佳工作点和最稳定工作点数据

统计试验方法

为了能够在HPLC高效液相色谱分离技术的分离结果达到很高的质量水平统计试验方法DoE是一个不可或缺的工具。当HPLC高效液相色谱分离中的7个重要参数同时都在变化时，才有可能找到高效液相色谱分离的最稳定工作点、实现多个目标值的同时最佳化。在最稳定工作点的优化中，应有参数在一定范围内变化而不损失目标值的可能性。最稳定工作点能够保证HPLC高效液相色谱分离过程的有着很高的最稳定性，失误率低于0.1%。