Q1. 怎么改变流动相比例来延长保留时间?
问题描述：
做的黄酮苷，用甲醇+乙腈+四氢呋喃+醋酸(1:1:19.4:78.6)溶液做流动相，现在分离效果不理想，想延长保留时间看看怎么样，也就是增大流动相的极性，给点建议，谢谢！PS：用的C18柱。
解答：
用液相色谱，C18柱分离黄酮苷，不是太清楚为什么要选用甲醇+乙腈+四氢呋喃+醋酸这样一种很复杂的流动相体系，难道体积分数78.6%的醋酸是直接用的冰醋酸？这是一种很不可思议的流动相配比。建议直接使用甲醇-水，或是乙腈-水作为流动相，水相中可以适当加点甲酸或是乙酸来得到最佳分离效果。
Q2. 保留时间为什么总在变？
问题描述：
苯甲酸的测定中流动相走了很久，进样以后，保留时间还是变，难道这个项目的柱子这么难平衡么？
解答：
保留时间一直在变，说明系统没有平衡好，可以从多个方面去排查原因。
a.流动相可能是最主要的原因，流动相平衡时间是否充足，管路有没有气泡，流动相中有机相是否蒸发，比例阀工作是否正常？
b.泵有可能存在问题，输液是否正常，压力是否稳定，泵密封垫是否完好，是否有漏点？
c.色谱柱也需要排查，是否恒温，是否有漏液？
Q3. 液相色谱中影响峰扩散的有那些因素？
问题描述：
液相色谱中影响峰扩散的有那些因素？与气相色谱相比，有哪些不同之处？
解答：
气相色谱与液相色谱在速率理论方程上的差异主要是由于气体与液体的性质差异造成的。液体的黏度比气体大约100倍，表面张力大约10000倍，密度大约1000倍；气体还具有高压缩性系数。溶质在液体中的扩散系数要远远小于在气体中，液相在传质过程中对理论塔板高度的影响尤其的大。与气相色谱速率理论方程不同的是，液相色谱增加了固定相孔结构内滞留流动相传质项。
因此我们可以得知主要有以下几个方面会影响色谱峰扩张：
1.涡流扩散
涡流扩散是由于柱填料粒径大小不同及填充不均匀等因素造成的流动相在色谱柱内迁移过程中发生的涡流运动。
2.分子扩散
分子是由于进样后，溶质分子在柱内纵轴上存在浓度梯度，引起浓差扩散而使谱带展宽。由于液体流动相的传质速度较慢，分子扩散项B/u可以忽略不计。
3.传质阻力
溶质分子与固定相、流动相分子间存在相互作用，扩散、分配、转移的过程并不是瞬间达到平衡，实际传质速度是有限的，总是存在超前与滞后现象。这使色谱柱总是在非平衡状态下工作，从而产生峰展宽。
4 流速
一般难以观察到最低H对应的最佳流速，因为流速降低，H总是降低。当u>uopt时，H随着u升高而升高，传质引起的色谱峰扩张也会更明显。
5 固定相颗粒大小
涡流扩散项A和流动相传质阻力项Cm均与柱填料粒径dp的平方成正比，所以固定相粒径与色谱峰扩张有很大的关系。
6 柱温
色谱柱温直接影响到分子在固定相和流动相中的扩散系数DS和Dm，从而影响分子扩散和传质的速率。柱温升高，DS和Dm升高，分子扩散导致柱效降低；而传质改善又导致柱效升高；因此柱温对色谱峰扩张的影响是矛盾的。
Q4. 液相色谱使用缓冲盐的注意事项
解答：
1、避免使用盐酸盐，盐酸盐对钢质有腐蚀作用。
2、缓冲液最好要现配现用，往往缓冲液是良好的菌类培养液，隔天或放置长时间实验时会有很多怪现象发生。
3、实验后不可用有机溶剂直接过度，有机溶剂会处使盐类析出，造成液路或色谱柱堵塞，可用95：5的水甲醇冲洗。
4、使用缓冲液要及时掌握pH范围，做到胸中有数。
5、清洗液路和柱子时，有温控可加热到30℃易于冲洗。
6、长时间用缓冲溶液要注意观察接头处有无析出，若有白色盐类析出，可考虑一定周期用10%硝酸冲洗一下液路(拆下柱子，走30ml，再用5倍水冲洗)可以避免液路的堵塞。
7、选择缓冲液要用可靠的试剂，避免不纯的盐类造成不必要的麻烦。
如果流动相中有机溶剂的比例很高是不能用来冲洗缓冲盐的，是洗不出来的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇冲洗，是可以把缓冲盐冲洗出来的，然后用纯的有机溶剂来保护柱子。最好的方法是使用与流动相相同浓度不含盐的流动相进行清洗。但就是速度慢一些。用水是为了快速替换，一般在15分钟以内最好，且用0.8的流速较好。如果用纯水冲，容易造成键合的碳链的流失，最好用5%~10%甲醇水溶液冲。可以用纯水代替流动相中的缓冲液，有机相不变。这样冲洗柱子比较稳妥。
Q5. 影响出峰时间的因素有哪些？
问题描述：
pH值不同出峰时间不同，具体原理是什么？除了pH值会影响，还有其他因素吗？
解答：
流动相的pH值主要是影响到分配系数而出峰时间的不同。
影响出峰时间的因素有很多，从分配系数、容量因子等各个方面考虑，与目标化合物在固定相和流动相中的分配性质有关，还与流速，压力，柱温等液相色谱仪参数有关，具体涉及下面几种因素的影响：
a.目标化合物本身，具体包括分子量、结构、化合物类型、极性等；
b.流动相，具体包括流动相构成、配比、流动相各组分极性，洗脱方式，流速等；
c.固定相，具体包括固定相种类，结构，色谱柱长度等；
d.分配系数与容量因子，具体包括化合物在流动相与固定相之间的分配情况，柱温等。
Q6. 有没有方法将保留时间提前？
问题描述：
我现在用液相色谱做含量测定时，保留时间太长，20分钟左右才出峰，有没什么方法提前，原理是什么？
解答：
可以从通过改变目标组分容量因子k的方式，以及缩短柱长增加柱温等方式，具体可以采取以下方法：
a.调整流动相，具体包括流动相构成、配比、流动相各组分极性，洗脱方式，提高流速等；
b.调整固定相，具体包括固定相种类，结构，缩短色谱柱长度等；
c.增加柱温，降低流动相传质阻力等。
Q7. 流动相使用前为什么要脱气？
解答：
首先我们了解一下不脱气可能造成的影响：
气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。
溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相（如烷基胺）发生反应，降解而改变柱的分离性能。
溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。
若用FLD（荧光检测器），溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。
脱气的作用：除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。
排出气泡能减少泵工作的伤害，提高UV检测器的性能高，改善灵敏度。
脱气的方式：加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染，同时需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。
抽真空脱气法：易抽走有机相。
超声脱气法：流动相放在超声波容器中（一般500ml溶液需超声20~30min），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。
氦气脱气法：在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。主要利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。
在线真空脱气法：利用在线脱气机在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，
脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
Q8. 怎样提高高效液相色谱法的柱效？
解答：
1.要想提高液相色谱法的柱效，应当用小而均匀的固定相颗粒填充均匀，以减小涡流扩散和流动相传质阻力，这是最佳的提升柱效的方法。
2.改进固定相的结构，可以减小滞留流动相传质阻力以及固定相传质阻力。
3.选用低粘度的流动相(如甲醇、乙腈等)，也有利于减小传质阻力，提高柱效。
4.合适的柱温，也会影响到柱效。
5.降低流速、增加柱长也可以提高柱效。
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