01试剂/溶剂
高效液相色谱法中,常用的试剂主要是有机溶剂、各种盐类及水。有机溶剂一般多为购买的色谱级,所以出现问题的几率较小。但是分装出的有机溶剂,由于多次使用,被污染的概率较大,因此引入干扰峰的几率较高。
其次是水,水中的杂质是干扰峰的主要来源之一,这是大家极易忽视的问题。采集波长较低的检测方法,建议使用高品质水,这样可以避免很多因为水质带来的问题。再次是各种盐类,这也是色谱干扰峰的主要来源之一。如图2所示,与图1相比,如图2加入磷酸二氢钾后,16.5min处出现干扰峰。对于无机盐引入的干扰峰,在方法开发初期一般就会给眼关注,寻找解决方案。方法确定后,盐的品种及级别也同时确定,因此盐对方法的影响基本可控。
水和无机盐引起的干扰峰,比较快捷的解决方案是安装鬼峰补集柱,这样可以有效的避免此类干扰。如果使用离子对试剂,则需选择不影响离子对试剂的鬼峰补集柱。
02器材
首先是流动相配制过程中接触的器材,包括烧杯、玻璃棒、pH计、滤杯、滤膜、流动相瓶等。烧杯、玻璃棒是配制流动相首先接触的器材,因此建议配制流动相的烧杯、玻璃棒专用。滤杯实验人员只要清洗干净一般不会带来污染。需要注意的是,如果过滤含有离子对的流动相,建议增加清洗次数,避免清洗不干净污染后续流动相。因此,对滤杯的清洗应该建立基本的洗涤规程,保证实验人员对使用的器材清洗到位。滤膜也是干扰峰引入源头之一。
如图3所示,乙腈经过有机系滤膜过滤后,在梯度洗脱中会引入较大干扰峰。鉴于色谱级试剂厂家已经过膜,且多数仪器都有脱气机,所以笔者建议无需再对甲醇、乙腈等纯有机相过滤。流动相瓶引入干扰峰的现象主要出现在夏季,这是由于夏季温度高,纯水相容易滋生细菌。后续的流动相瓶使用人员清洗不到位,所以导致引入干扰峰。因此流动相瓶的清洗要建立严格的洗涤规程。
再次样品前处理过程中接触的器材。前处理过程中接触的器材主要包括容量瓶、滤头、注射器及进样瓶。容量瓶的清洗同流动相瓶、过滤装置一样,要建立良好的清洗规程。移液器材以及滤头、注射器,多为塑料制品,其化学惰性较玻璃制品差,因此容易引入干扰峰。如下图4、图5、图6所示案例,此方法检测波长为210纳米,溶剂为正己烷-异丙醇(90:10),溶剂分别接触移液枪枪头、一次性吸管、一次性注射器后,均引入不同的干扰峰。
进样小瓶若为一次性使用,一般不会引入干扰峰。如果进样瓶反复清洗,多次使用,则应建立清洗规程并对其清洗干净程度进行确认。
03液相系统
与前两类干扰峰相比,液相系统干扰峰的解决更加困难。液相系统是一个动态过程,所以此类问题解决过程耗费时间长,而且要求实验人员有很高的色谱素养。对此类问题来源主要归结为三类:强保留物质、离子对污染和管路滋生细菌。
首先是强保留物质的干扰,其主要特征是宽峰。此类问题多数发生在等度洗脱中,梯度洗脱主要出现在高比例有机相处。这是由于强保留物质在当次进样中未洗脱出,在后续进样洗脱出来所致。如图7中9分钟处的色谱峰。
展源
何发
加载更多